¿Qué es la desnaturalización del ADN: desnaturalización térmica, preguntas frecuentes sobre imp

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¿Qué es? Desnaturalización del ADN

Durante la replicación de ADN y otro fenómeno diferente en el que se observa la participación activa del ADN con la separación de hebras de ADN de doble hélice.

Las hebras de la doble hélice de ADN se pueden segregar simplemente calentando el ADN disuelto a altas temperaturas. Los grupos de ADN se separan debido a la ruptura de los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las bases nitrogenadas complementarias presentes en las cadenas opuestas. Este fenómeno se conoce como fusión del ADN.

Figura: Enlaces de hidrógeno presentes entre los base de nucleótidos los pares son la principal fuerza estabilizadora del ADN. Credito de imagen: Wikipedia

El grado de fusión está determinado por la temperatura de fusión (Tm) que se caracteriza como la temperatura a la que se pierde casi el 50% de la estructura de doble hélice.

Las hebras de doble hélice de ADN también se pueden separar mediante la adición de álcali o ácido, los enlaces de hidrógeno se rompen por ionización.

El ADN de doble hélice absorbe menos luz UV en comparación con la hebra única de ADN debido al apilamiento de pares de bases. Cuando el ADN se derrite, el porcentaje de ADN monocatenario aumenta, lo que da como resultado un aumento en el perfil de absorción de UV. Este fenómeno se conoce como hipercromía. Por tanto, el grado de desnaturalización o fusión se puede controlar midiendo la absorbancia a 260 nm.

desnaturalización del ADN
Figura: Representación esquemática del proceso de desnaturalización del ADN. Credito de imagen: Wikimedia

Renaturalización del ADN

Las hebras de ADN segregadas comienzan a templarse inmediatamente cuando la temperatura desciende por debajo de la Tm valor. Este ciclo de recocido a menudo se denomina renaturalización. La propiedad de desnaturalización y renaturalización es muy importante para el funcionamiento biológico óptimo del ADN.

En el entorno celular, las hebras de ADN se segregan por la acción de enzimas como la helicasa y la topoisomerasa a expensas de la energía (ATP), no por la acción del calor o del pH extremo.

La capacidad del ADN para desnaturalizarse y volver a recocerse de forma reversible proporciona evidencias de la expresión génica y de la posición y estructura de un gen.

Digamos, por ejemplo, si las partículas de ADN de dos organismos vivos distintos se desnaturalizaran y se les permitiera volver a hibridarse o hibridarse entre sí. Las hebras formarán híbridos de ADN si las secuencias son similares entre sí. El grado de hibridación indica el grado de similitud entre el ADN de dos organismos.

Se pueden hacer observaciones similares con ADN y ARN dentro de la célula para localizar genes.

Desnaturalización térmica del ADN

El ADN se puede desnaturalizar mediante calor y este proceso es el mismo que el de la fusión. La muestra se calienta hasta que el ADN se desenrolla y se separan dos hebras. Cuando las hebras se hayan separado, el ADN, en ese punto, podrá alcanzar una temperatura constante. Este proceso permite dar forma a las hebras en la hélice de ADN, que luego, en ese punto, crea emparejamientos complementarios que pueden tomarse como marcadores.

La desnaturalización térmica se utiliza de vez en cuando cuando se busca la diferencia entre especies distintas. Sin embargo, la desnaturalización o fusión del ADN es un proceso realmente simple y directo, no se utiliza cuando se requiere precisión. La desnaturalización térmica del ADN se considera menos precisa que la secuenciación del ADN y se utiliza para aplicaciones mucho más amplias. Este tipo de desnaturalización también se puede utilizar dentro de la respuesta de la cadena de polimerasa.

Figura: Perfil de desnaturalización térmica del ADN. Una temperatura más alta promueve la separación de las hebras y una temperatura a la que se separa la mitad del ADN se conoce como temperatura de fusión o Tm. Credito de imagen: Wikimedia

Desnaturalización del ADN mediante tratamiento con NaOH

Además de calentar la muestra de ADN, también se pueden usar productos químicos como NaOH para lograr la desnaturalización del ADN. Se puede utilizar una concentración específica de NaOH para desnaturalizar el ADN. A medida que se reduce la cantidad de NaOH utilizado, la desnaturalización llevará más tiempo de lo esperado; sin embargo, el ADN puede, en cualquier caso, desnaturalizarse por completo. Se ha demostrado que el NaOH es quizás la mejor y más eficaz estrategia para la desnaturalización completa del ADN.

Diferentes agentes químicos, por ejemplo, la formamida, no pueden desnaturalizar el ADN tan rápidamente. Dado que el NaOH se puede utilizar en varias concentraciones, también es fácil de controlar sin ningún problema. Además, el ADN que se desnaturaliza con NaOH se puede renaturalizar usando una solución tampón de fosfatos. El ADN que se desnaturaliza a través de diferentes agentes químicos, como DMSO (dimetilsulfóxido), no se puede renaturalizar completamente de esta manera, y esto puede resultar en el uso de NaOH para más aplicaciones. 

Desnaturalización del ADN a través de la sal

Una gran cantidad de sal en el medio hará que el ADN se desnaturalice normalmente, dada la proporción correcta de sal. La desnaturalización del ADN con sal es como la desnaturalización con disolventes orgánicos. generalmente, la desnaturalización del ADN con sal no se puede renaturalizar. La sal se utiliza con frecuencia en lugar de un ácido para desnaturalizar completamente el ADN y también se puede utilizar junto con el calor. La sal no se utiliza generalmente como el único agente de desnaturalización; normalmente se utiliza con algunos compuestos químicos diferentes como el isopropanol y el etanol.

Este proceso se puede utilizar para desnaturalizar mayores volúmenes de ADN, lo que lo hace menos útil para el trabajo explícito, pero más valioso para aumentar y procesar el ADN en mayores cantidades.

Sin embargo existen numerosos procedimientos relacionados con la desnaturalización del ADN, el producto final es algo similar: se rompen las conexiones entre las hebras y se produce el ADN monocatenario, que se puede determinar por varios métodos. El mejor método de desnaturalización del ADN se basa en para qué se debe utilizar el ADN, qué tan exactas y explícitas deben ser las correlaciones y el volumen de material que debe procesarse.

Como regla general, tanto la desnaturalización térmica como la sal se pueden escalar fácilmente y utilizar con cantidades mayores, mientras que la desnaturalización con NaOH podría ser marginalmente más precisa y valiosa para pequeñas cantidades de ADN.

Figura: Mecanismo de desnaturalización del ADN a través de formamida. Credito de imagen: Wikimedia

¿Qué paso de la PCR provoca la desnaturalización del ADN bicatenario?

La separación de las cadenas de ADN tiene lugar en el paso de desnaturalización de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que se describe en los siguientes pasos:

  • En este paso, la mezcla de reacción que contiene la plantilla de ADN se calentó a una temperatura muy alta (94-95 ° C).
  • ¿La alta temperatura rompe los enlaces de hidrógeno? Entre la hebra de ADN
  • Dando como resultado dos fragmentos de ADN de una sola hebra.
  • La alta temperatura es crucial para la separación de las cadenas de ADN.
  • La desnaturalización se completa en 20 segundos.

Efecto de la urea sobre la desnaturalización del ADN

Al igual que la desnaturalización del ADN inducida por el pH y la temperatura, la urea también posee la capacidad de desnaturalizar el ADN. La urea en grandes cantidades aborda una condición problemática de las estructuras de ácidos nucleicos. Dado que la urea es donante y aceptor de enlaces de hidrógeno, indudablemente puede desnaturalizar los ácidos nucleicos. De hecho, la urea 6–8 M es el componente crítico para desnaturalizar la electroforesis en gel de poliacrilamida (dPAGE) ampliamente utilizada para la separación de oligonucleótidos de ADN sobre la base del tamaño. En esta estrategia, las dobles hélices de ADN se desnaturalizan totalmente y viajan en gel de poliacrilamida / agrosa como polímeros lineales.

Para nuestro asombro increíble, revisamos una partícula de ADN que puede dar forma a una estructura plegada en urea 7 M (7MU), que se mantiene estable durante el ciclo de 7MU-dPAGE. Esto se debe al hecho de que este ADN tenía una concentración muy alta de nucleótido de guanina y formaba estructuras cuádruples.

Conclusiones

En este artículo hemos hablado de la desnaturalización del ADN, que se explota con mucha frecuencia en el campo de la biología molecular como una herramienta eficaz para cambiar, manipular y formar ADN recombinante. Hemos discutido la desnaturalización a la luz de diferentes desnaturalizantes que se sabe que perturban las fuerzas estabilizadoras de Estructura del ADN.

Preguntas y respuestas de la entrevista

Q1 ¿Por qué se desnaturaliza el ADN?

Respuesta Como sabemos, la estabilidad del ADN es importante para que todas las células vivas funcionen correctamente. Pero, hay determinadas ocasiones en las que la desnaturalización del ADN es beneficiosa para que la célula lleve a cabo procesos de vida normales. El ADN se desnaturaliza para producir dos cadenas de polinucleótidos, se lleva a cabo con la ayuda de enzimas específicas como girasa, topoisomerasa y helicasa y la desnaturalización a menudo se localiza.

Los procesos celulares importantes como la replicación y la transcripción del ADN requieren la separación del ADN. mientras que el fenómeno de desnaturalización se utiliza a menudo en técnicas avanzadas de biología molecular como la reacción en cadena de la polimerasa, huellas dactilares de ADN, etc.

P2 ¿Qué causa la desnaturalización?

Respuesta Las hebras de ADN se mantienen unidas por interacciones no covalentes como los enlaces de hidrógeno. La ruptura de estos enlaces de hidrógeno provoca la separación de las hebras de ADN, lo que se conoce como desnaturalización del ADN. Los enlaces de hidrógeno presentes entre los nucleótidos del ADN se pueden romper de varias formas.

  • Desnaturalización del ADN por calor: Desnaturalización térmica del ADN
  • Desnaturalización del ADN por pH extremo: desnaturalización inducida por pH del ADN
  • Desnaturalización del ADN por sales: La solución salina induce la desnaturalización del ADN

Q3 Factores que afectan la desnaturalización del ADN

Respuesta La desnaturalización del ADN depende de los siguientes factores

  • Temperatura: el ADN de cada organismo tiene una temperatura fija de fusión / desnaturalización
  • pH: el ADN se desnaturaliza a un pH extremo
  • Osmolaridad y salinidad: la concentración extrema de sal también induce la desnaturalización del ADN
  • Contenido de guanina-citosina: cuanto mayor sea el contenido de GC en el ADN, mayor será la temperatura de fusión
  • Contenido de adenina-timina: cuanto mayor sea el AT en el ADN, menor será la temperatura de fusión

Q4 Temperatura de desnaturalización del ADN

Respuesta Cuando la solución de ADN se calienta por encima de 90oC, el aumento de la energía cinética es suficiente para alterar los enlaces de hidrógeno no covalentes presentes entre las dos cadenas de ADN. Estas interacciones no covalentes son responsables de estabilizar el ADN. La alteración de estas fuerzas conduce a la desnaturalización del ADN. Generalmente, la temperatura de fusión del ADN de cada organismo es superior a 90ºC.oC.

P5 ¿A qué temperatura tiene lugar la desnaturalización de la doble hélice del ADN?

Respuesta Generalmente, la temperatura de fusión o desnaturalización del ADN de un organismo es cercana o superior a 90ºC.oC.

P6 ¿Cómo ayuda la desnaturalización del ADN a analizar sus estructuras?

Respuesta Cuando comienza la desnaturalización del ADN, la absorción de UV a 260 nm aumenta gradualmente y alcanza el máximo hasta que las dos hebras de ADN se separan por completo. El cambio en la absorción de UV da una idea del grado de desnaturalización y renaturalización.

P7 ¿Por qué no se destruye el ADN desnaturalizado?

Respuesta La desnaturalización del ADN ocurre debido a la rotura de interacciones no covalentes, por lo que solo se desnaturaliza, no se destruye. Las hebras de polinucleótidos están formadas por un esqueleto de fosfato de azúcar que está formado por enlaces covalentes (enlaces) que no se rompen durante el proceso de desnaturalización.

P8 ¿Es reversible la desnaturalización del ADN?

Respuesta Sí, el proceso de desnaturalización del ADN es reversible. Cuando la temperatura desciende, las hebras de ADN separadas comienzan a recocerse debido a la formación de enlaces de hidrógeno entre la secuencia complementaria de ADN. El recocido del ADN promueve la restauración de la estructura de doble hélice del ADN y, por lo tanto, la desnaturalización del ADN es un proceso reversible.

P9 ¿Por qué es más fácil desnaturalizar el ADN que las proteínas?

Respuesta Tanto el ADN como las proteínas se pueden desnaturalizar mediante el uso de desnaturalizantes como calor, pH extremo, alta concentración de sal y la presencia de otros desnaturalizantes químicos. La desnaturalización del ADN es fácil de entender, mientras que la desnaturalización de las proteínas es un fenómeno complejo porque la estructura de las proteínas se estabiliza mediante interacciones covalentes y no covalentes. Algunas proteínas pueden desnaturalizarse muy fácilmente, mientras que otras proteínas se desnaturalizan en condiciones muy extremas.

P10 Si el ADN no es una proteína, ¿por qué decimos que el ADN podría desnaturalizarse?

Respuesta Se dice que una biomacromolécula se desnaturaliza cuando comienza a perder su integridad estructural o cuando cambia de estructura. Dado que el ADN también tiene una estructura bien definida, cuando la estructura del ADN cambia podemos decir que el ADN se está desnaturalizando.

P11 ¿Por qué se utilizan controles durante la electroforesis?

Respuesta Los controles (positivos y negativos) se suelen utilizar cuando realizamos la electroforesis de ADN. Usamos el control para verificar el estado de la estructura del ADN de la muestra (si es bicatenario, monocatenario, parcialmente bicatenario, mellado, etc.). El ADN bicatenario corre más rápido en el gel de agarosa en comparación con el ADN monocatenario, mientras que el ADN mellado corre más lento.

Figura: Electroforesis de ADN en gel de agarosa. Credito de imagen: Wikimedia

P12 ¿Qué sucede cuando se daña el ADN?

Respuesta El ADN dañado o mellado es más lento, se retrasa y tiene poca movilidad. Así, el ADN mellado o dañado cubre distancias cortas en la electroforesis en gel de agarosa.

P13 ¿Qué enlaces se rompen primero cuando se produce la desnaturalización de las proteínas?

Respuesta Los enlaces de hidrógeno junto con otras interacciones no covalentes (fuerzas hidrófobas, de vander waal) se alteran primero, mientras que las interacciones covalentes como los enlaces disulfuro se rompen en último lugar durante el proceso de desnaturalización.

P14 ¿Cómo se transfiere el ADN de la cepa S muerta por calor a la cepa R rugosa considerando el hecho de que el ADN puede sufrir desnaturalización?

Respuesta Durante la matanza por calor de la cepa virulenta S de Pnuemococcus, su ADN se desnaturaliza pero, cuando se mezcla con la cepa R, la temperatura no es tan alta. Por lo tanto, el ADN podría volver a recocerse durante el proceso de mezcla y restaurar su funcionalidad.

P15 ¿Puede la desnaturalización de proteínas significar dividirlas en partes detectables más fundamentales pero funcionales?

Respuesta No, la desnaturalización solo tiene como objetivo cambiar la estructura de las biomacromoléculas. El cambio de estructura provoca un cambio o pérdida en la función de estas moléculas. La desnaturalización no significa destruir o dividir en unidades fundamentales. La desnaturalización no es digestión.

P16 ¿Cuál es la diferencia entre la ADN polimerasa térmicamente estable y las ADN polimerasas normales?

Respuesta La ADN polimerasa termoestable se obtiene de una bacteria extremófila Thermus aquaticus, es diferente de la ADN polimerasa normal porque puede realizar la replicación del ADN incluso a una temperatura superior a 90ºC.oC.

P17 ¿Por qué la desnaturalización de hélices de ADN más largas muestra más cooperatividad que la desnaturalización de hebras cortas?

Respuesta Dado que las cadenas de ADN más grandes tienen más nucleótidos, hay más posibilidades de formar pares de bases complementarios, hay más posibilidades de que se formen un gran número de enlaces de hidrógeno. Por lo tanto, los fragmentos de ADN más grandes muestran más cooperatividad.

P18 ¿Por qué el NaOH desnaturaliza el ADN?

Respuesta La introducción de NaOH aumenta el pH del medio y lo vuelve alcalino, los iones OH liberados del NaOH interactúan con la guanina y la timina y promueven la ruptura de los enlaces de hidrógeno, lo que finalmente conduce a la desnaturalización del ADN.

P19 ¿Puede la desnaturalización del ADN provocada por el formaldehído afectar las huellas dactilares del ADN?

Respuesta No, el formaldehído no afectará el resultado de la toma de huellas dactilares de ADN. Dado que la huella de ADN requiere digestión de restricción y las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas en el ADN de doble hebra. El formaldehído puede desnaturalizar el ADN, pero después de la eliminación del formaldehído (ya que solo se usa en el proceso de fijación después de la electroforesis), el ADN vuelve a su conformación original, por lo que las huellas dactilares del ADN no se ven afectadas.

P20 ¿Existe algún instrumento disponible que pueda distinguir el ADN desnaturalizado del ADN normal aparte de la electroforesis en gel?

Respuesta Sí, hay algunas herramientas e instrumentos que funcionan según el principio de la espectroscopia para la determinación de la temperatura de fusión y de ahí podemos distinguir entre ADN desnaturalizado y normal. Otra técnica es la electroforesis en gel de agarosa de muestras de ADN.

P21 ¿Cuál es el efecto sobre la desnaturalización del ADN si el valor de Tm aumenta la relación entre el valor de Tm y la desnaturalización del ADN?

Respuesta El valor de Tm más alto indica que la estructura del ADN tiene más estabilidad en comparación con el ADN que tiene un valor de Tm más bajo.

Sobre el Dr. Abdullah Arsalan

Soy Abdullah Arsalan, completé mi doctorado en Biotecnología. Tengo 7 años de experiencia en investigación. Hasta ahora he publicado 6 artículos en revistas de renombre internacional con un factor de impacto promedio de 4.5 y pocos más están en consideración. He presentado trabajos de investigación en diversos congresos nacionales e internacionales. Mi área temática de interés es la biotecnología y la bioquímica con especial énfasis en la química de proteínas, enzimología, inmunología, técnicas biofísicas y biología molecular.

Conectémonos a través de LinkedIn (https://www.linkedin.com/in/abdullah-arsalan-a97a0a88/) o Google Scholar (https://scholar.google.co.in/citations?user=AeZVWO4AAAAJ&hl=en).

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