Reacción en cadena de la polimerasa | Una herramienta importante en biotecnología molecular

PCR - Acrónimo de reacción en cadena de la polimerasa con marcador, concepto de fondo
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Reacción en cadena de la polimerasa | Una herramienta importante en biotecnología molecular

Contenido

¿Qué es la reacción en cadena de la polimerasa?

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es otro Biología Molecular técnica para producir ADN enzimáticamente sin utilizar maquinaria celular, por ejemplo, levadura o E. coli. El método permite una cantidad limitada de ADN para ser amplificado varios pliegues dramáticamente. PCR se utiliza regularmente en por, forensey laboratorios biológicos para diversos fines, como determinar huellas genéticas, diagnóstico de enfermedad, clonación de genes, y prueba de paternidad

Esta técnica fue creada en 1983 por Kary Mullis. La PCR es actualmente un procedimiento crucial y significativo utilizado en biología aplicada. Estos incorporan Clonación de ADN para secuenciación, filogenia basada en ADN o investigación activa de la expresión génica y la determinación de enfermedades de transmisión genética. En 1993, Mullis recibió el premio Nobel de Química por su trabajo en PCR. 

La PCR se lleva a cabo generalmente en una mezcla de reacción de un volumen total de 0.1-0.2 ml en tubos de reacción (volúmenes de 0.2-0.5 ml) en un instrumento conocido como un termociclador. Un termociclador calienta y enfría el ADN para alcanzar las temperaturas requeridas en cada paso de la reacción. Los tubos de reacción de paredes delgadas proporcionan la conductividad térmica deseada permitiendo un equilibrio térmico más rápido. Por lo general, los termocicladores tienen tapas o tapas calientes que evitan la condensación de los componentes de reacción en la parte superior del tubo. 

Reacción en cadena de la polimerasa
Figura: Ciclador térmico
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Requisitos de la reacción en cadena de la polimerasa

  • ADN fragmento a amplificar (plantilla de ADN o ADNc)
  • Primeros (cebador directo y cebador inverso) capaz de reconocer los extremos del ADN molde. Los cebadores suelen tener una longitud de 18 a 25 pares de bases.
  • ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa) cataliza la síntesis de ADN. La polimerasa Taq se obtiene de Thermus aquaticus.
  • Los nucleótidos
  • Buffer (proporciona un medio óptimo para la actividad de la ADN polimerasa termoestable)
Figura: el ADN se amplifica mediante PCR
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Principio de funcionamiento de la reacción en cadena de la polimerasa

La PCR se denomina reacción en cadena porque las hebras recién sintetizadas actuarán como molde para una mayor síntesis de ADN en los ciclos posteriores. 

La PCR consta de 3 reacciones sucesivas:

  • Desnaturalización del ADN: El proceso de desnaturalización separa las hebras de ADN de doble hebra. Para el ADN humano, la temperatura de desnaturalización es de aproximadamente 93-95oC. La desnaturalización del ADN se realiza rompiendo los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas de polinucleótidos del ADN. El proceso de desnaturalización se realiza a menudo durante 5 minutos o un tiempo prolongado para garantizar que ambas hebras del ADN molde estén completamente separadas entre sí. El proceso de desnaturalización también activa la ADN polimerasa termoestable.
  • Recocido de imprimación: Después de la desnaturalización, se introducen cebadores directos e inversos en la mezcla de reacción. A continuación, la solución se enfría para el recocido de la imprimación. Por lo general, el recocido del cebador se produce entre 50 y 70oC dependiendo de la Tm (temperatura de fusión) del ADN. Idealmente, la temperatura de recocido es 5oC por debajo de la Tm. La temperatura de hibridación debe ser baja para formar un híbrido entre el cebador y el ADN molde y lo suficientemente alta para evitar híbridos que no coinciden. La Tm del ADN depende únicamente del contenido de GC y AT del ADN. El paso de recocido de la imprimación suele tardar entre 1 y 2 minutos. La Tm puede determinarse experimentalmente o calcularse teóricamente mediante la fórmula que se menciona a continuación:

Tm = [4 x (G + C)] + [2 x (A + T)]oC

  • Síntesis de ADN: La ADN polimerasa termoestable (polimerasa Taq) se une cerca de la región de unión del ARN e incorpora los nucleótidos libres para alargar y sintetizar una nueva hebra de ADN adyacente a la hebra molde. La temperatura óptima del paso de extensión depende del tipo de polimerasa utilizado; para la polimerasa Taq, la temperatura óptima es de aproximadamente 72oC. La duración de este paso de extensión depende de la longitud del ADN molde y de la eficacia de la ADN polimerasa termoestable; por lo general, es un kilopares de bases por minuto.

Todas las reacciones mencionadas anteriormente se repiten 30 veces para obtener aproximadamente mil millones de copias del ADN molde.

Figura: Representación esquemática de la amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa
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Etapas de la reacción en cadena de la polimerasa

El proceso de PCR se divide en tres etapas:

  • Amplificación exponencial: La ADN polimerasa realiza la función óptima y, después de completar cada ciclo, la cantidad de producto se duplica. Solo es necesario que haya una pequeña cantidad de ADN en el punto de partida de la reacción, ya que la reacción es muy sensible.
  • Etapa de nivelación: La ADN polimerasa muestra menor actividad debido a la menor disponibilidad de reactivos como los nucleótidos.
  • Bandeja: no se forma más producto debido al agotamiento del reactivo.

Usos de la reacción en cadena de la polimerasa

La PCR se puede utilizar para identificar numerosas anomalías ligadas al genoma, una amplia gama de análisis y experimentos. A continuación se analizan algunos ejemplos del uso de PCR:

  • Identificación de agentes infecciosos como CMV, Mycoplasma, Neumonía, enfermedades contagiosas y protozoarias, hepatitis, etc. en la muestra.
  • Determinación de malignidad, específicamente en el caso de linfoma y leucemia. 
  • Pruebas de paternidad y toma de huellas genéticas. 

La PCR permite la identificación temprana de anomalías que actualmente son las más desarrolladas en la investigación del cáncer. Las medidas de PCR se pueden realizar directamente en las muestras de ADN genómico para reconocer células malignas específicas de translocación con una sensibilidad de más de 10,000 veces en comparación con cualquier otro método. 

La PCR también identifica microorganismos no cultivables y de crecimiento lento, como micobacterias, microorganismos anaerobios y virus, a partir de técnicas de cultivo de tejidos y modelos basados ​​en animales. Las aplicaciones demostrativas de la PCR en microbiología son el reconocimiento de patógenos y la capacidad de diferenciar entre cepas no patógenas de patógenas identificando los genes específicos. 

La PCR se utiliza para intensificar un fragmento corto de una hebra de ADN. Esta cadena de ADN puede ser un gen completo o simplemente una parte de un gen. A diferencia de los sistemas vivos, el ciclo de la PCR puede amplificar solo fragmentos cortos de ADN. hasta 10 kilopares de bases. Varias otras técnicas pueden amplificar fragmentos de ADN de hasta 40 kb de tamaño, que aún es menor que el tamaño del ADN cromosómico de una célula eucariota; por ejemplo, una célula humana contiene aproximadamente tres mil millones de pares de bases de nucleótidos. 

Prueba paterna se puede realizar mediante PCR tomando el ADN de las personas que tienen la disputa. El ADN de los individuos de prueba se amplifica y digiere mediante enzimas de restricción y se analiza con electroforesis en gel. El patrón de los fragmentos de ADN en el gel de rosa se conoce como la huella de ADN del individuo. Las personas cercanas o relacionadas con la sangre tendrán una similar huella de ADN patrón en comparación con los individuos lejanos o no relacionados. Las huellas dactilares obtenidas se pueden analizar más a fondo para los padres e hijos o hermanos con dos o más huellas dactilares genéticas (ADN). Las huellas de ADN obtenidas se pueden utilizar para conocer las relaciones evolutivas entre los organismos. 

Su tamaño puede reconocer fácilmente el producto final de la PCR en electroforesis en gel de agarosa. La electroforesis en gel de agarosa se realiza inyectando las muestras de ADN en el gel de agarosa. La corriente eléctrica se pasa a través del gel de agarosa para conocer la movilidad de las muestras de ADN. Los fragmentos de ADN más pequeños se mueven más rápido en el gel y viceversa. El producto de la PCR y el fragmento de ADN de la muestra se identifican introduciendo una escalera de ADN en el gel de agarosa. La escalera de ADN contiene moléculas de ADN de tamaño conocido. 

Anteriormente, la identificación del trastorno genético mediante la observación del genoma era un trabajo difícil. Posteriormente, por el desarrollo de la PCR, este proceso se acorta. Cualquier gen de interés puede amplificarse fácilmente usando cebadores adecuados y luego secuenciarse para detectar mutaciones en el ADN. La identificación temprana de algunas infecciones virales letales también se puede realizar mediante PCR. 

Figura: Las huellas dactilares de ADN se utilizan para las pruebas paternas
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Tipos de reacción en cadena de la polimerasa

Basado en algunas modificaciones adecuadas en la técnica, Reacción en cadena de la polimerasa se clasifica en los siguientes tipos:

  • PCR anidado
  • PCR inversa
  • Transcripción inversa (RT-PCR)
  • PCR asimétrica
  • Cuantitativo (PCR-Q-PCR)
  • PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR)
  • PCR de contacto
  • PCR de colonias
  • PCR específica de alelos
  • Ensamblaje PCR o ensamblaje cíclico de polimerasa (PCA)
  • PCR asimétrica
  • Lineal después de la PCR exponencial (LATE-PCR)
  • PCR de salida
  • Amplificación dependiente de helicasa
  • PCR de arranque en caliente
  • PCR específica entre secuencias
  • PCR inversa
  • PCR mediada por ligadura
  • PCR específica de metilación
  • PCR mini-cebador

Ventajas de la reacción en cadena de la polimerasa

  • La reacción en cadena de la polimerasa se puede utilizar para la identificación de una variedad de anomalías genéticas.
  • La PCR se utiliza en una amplia gama de experimentos y procedimientos de laboratorio en biología molecular.
  • La PCR puede detectar malignidades como leucemia, linfoma, etc., y otras afecciones como Toxoplasma gondi, bacteriemia estafilocócica, infecciones por paludismo, etc.
  • La toma de huellas genéticas y las pruebas de paternidad implican la PCR como su paso crucial.
  • La alta sensibilidad y especificidad de la PCR la convierte en una herramienta importante para experimentos basados ​​en biotecnología y biología molecular.

Desventajas de la reacción en cadena de la polimerasa

  • La reacción en cadena de la polimerasa requiere un termociclador, un ensamblaje electroforético de ADN, un kit de aislamiento de ADN y otros productos químicos costosos que encarecen el proceso.
  • Requiere técnicos capacitados, calificados y con experiencia para realizar experimentos.
  • Se requieren laboratorios de nivel de seguridad básico con deshumidificadores e instalaciones de flujo laminar.
  • Es difícil costear las pruebas basadas en PCR para el público habitual.
  • No todas las enfermedades se pudieron identificar y diagnosticar mediante PCR.
  • Posibilidad de obtener resultados falsos positivos y falsos negativos.

conclusiones:

La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica comúnmente utilizada y ampliamente aceptada para la identificación de varios agentes infecciosos letales con sensibilidad y especificidad. La PCR se está utilizando en varios centros médicos de instalaciones avanzadas, laboratorios modernos e institutos médicos como un módulo de investigación y diagnóstico de rutina. La reacción en cadena de la polimerasa juega un papel crucial en la identificación de anomalías que representan síntomas clínicos atípicos; La PCR permite la detección temprana de este tipo de alteraciones. La detección temprana puede ayudar a manejar al individuo de una manera mucho mejor, lo que puede reducir la carga social y económica sobre la familia del sujeto.

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MCQ del verificador de conceptos

Pregunta no. 1: Un estudiante está realizando PCR para amplificar una muestra de ADN molde. Pero se olvidó de agregar un cebador de ADN en el experimento. ¿Cuál de las siguientes opciones representa el mejor resultado posible?

R- La reacción no se producirá.

B- La reacción funcionará, pero el proceso amplificará regiones no específicas (no la porción de ADN deseada del ADN.

C- La reacción funcionará pero a un ritmo prolongado

D- Reaction funcionará y el producto mostrará mutaciones no deseadas.

Opción A: “La reacción no se producirá” es la respuesta correcta.

Explicación: Los cebadores son esenciales para el funcionamiento de la PCR. La polimerasa Taq los necesita para unirse (en el paso de hibridación) para iniciar la replicación del ADN. Por tanto, la PCR no funcionará en ausencia de cebadores y no tendrá lugar ninguna amplificación.

Pregunta no. 2: Un estudiante / investigador desea insertar el gen de la hemoglobina humana en un vector de expresión para clonar y expresar el gen en células de ratón para analizar el fenotipo resultante. ¿Cuál de las siguientes secuencias de procedimientos permitirá al estudiante / investigador clonar el gen con éxito?

Opción A:

1. Amplificar el gen mediante PCR

2. Utilice una enzima de restricción para cortar el vector de expresión.

3. Ligar el gen y el vector digerido

Opción B: 

1. Ligar gen

2. Utilice una enzima de restricción para cortar el vector de expresión. 

3. Amplificar el gen y el vector de expresión digerido mediante PCR.

Opción C:

1. Utilice una enzima de restricción para cortar el vector de expresión.

2. Amplificar el gen mediante PCR

3. Ligar el gen y el vector digerido

Opción D:

1. Utilice una enzima de restricción para cortar el vector de expresión.

2. Ligar el gen y el vector digerido

3. Amplificar el gen mediante PCR

Opción A: Es el correcta opción 

1. Amplificar el gen mediante PCR

2. Utilice una enzima de restricción para cortar el vector de expresión.

3. Ligar el gen y el vector digerido

Explicación: En primer lugar, utilizaremos la PCR para amplificar el gen de interés del genoma humano que tiene sitios de restricción en los extremos (esto ayudará a su ligación a un vector digerido con enzimas de restricción). Más tarde, el vector de expresión necesita ser digerido usando la misma enzima de restricción, y luego el vector digerido y el gen amplificado se ligaron juntos. El producto final estará formado por dos segmentos: el vector original y el gen de interés.

Pregunta no. 3: ¿Qué instrumento se utiliza para completar la amplificación del ADN mediante PCR?

A- Analizador genético

B- espectrofotómetro UV

C- Termociclador

D- Centrífuga

Opción C: Thermocycler es la respuesta correcta

Explicación: El termociclador se puede configurar para que opere un ciclo de las etapas de desnaturalización, recocido y extensión, respectivamente, en una pequeña cantidad del volumen de reacción. Se utiliza un termociclador para realizar la amplificación por PCR.

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Sobre el Dr. Abdullah Arsalan

Soy Abdullah Arsalan, completé mi doctorado en Biotecnología. Tengo 7 años de experiencia en investigación. Hasta ahora he publicado 6 artículos en revistas de renombre internacional con un factor de impacto promedio de 4.5 y pocos más están en consideración. He presentado trabajos de investigación en diversos congresos nacionales e internacionales. Mi área temática de interés es la biotecnología y la bioquímica con especial énfasis en la química de proteínas, enzimología, inmunología, técnicas biofísicas y biología molecular.

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