Diferentes tipos de PCR: MCQ conceptuales importantes

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Diferentes tipos de PCR

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se clasifica ampliamente sobre la base de ligeras modificaciones en el proceso estándar de PCR. Los diferentes tipos de PCR son los siguientes:

PCR anidado

Se propone esta técnica para disminuir los contaminantes en el ADN amplificado debido a la amplificación de unión de cebadores aleatorios. La PCR anidada se realiza con dos conjuntos diferentes de cebadores en dos ciclos de PCR consecutivos. Se espera que el conjunto posterior amplifique el objetivo secundario dentro del producto de la serie primaria. Esta técnica tiene un éxito excepcional, aunque requiere mucho más conocimiento de las secuencias involucradas. 

PCR inversa

Se realiza cuando solo se conoce una única secuencia interna de ADN molde. Esta técnica es adecuada en la identificación de las secuencias flanqueantes de los diversos insertos de genes. El proceso incluye una secuencia de digestión y autoligación del ADN molde, que da como resultado fragmentos de ADN con secuencias conocidas en los extremos de una secuencia desconocida.

Diferentes tipos de PCR
(Diferentes tipos de PCR): Representación de la estructura molecular de la polimerasa Taq https://commons.wikimedia.org/wiki/File:PDB_1ktq_EBI.jpg

PCR de transcripción inversa (RT-PCR)

Se utiliza para amplificar e identificar secuencias conocidas de bibliotecas de ARN. El ARN obtenido de la muestra se convierte luego en ADN complementario (ADNc) por la acción de la enzima transcriptasa de enzima inversa. Posteriormente se ha realizado una PCR típica. La RT-PCR se utiliza ampliamente en la identificación y determinación de la expresión génica.

Diferentes tipos de PCR
(Diferentes tipos de PCR): RT-PCR utiliza fluoróforos para detectar los niveles de expresión génica https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Molecular_Beacons.jpg

PCR asimétrica

Amplifica selectivamente una hebra del ADN molde más que la otra. Se utiliza en el sondaje de hibridación en el que solo una hebra se considera ideal. La amplificación adicional se logra llevando a cabo una PCR estándar en presencia de un exceso de cebadores para la hebra elegida. 

PCR cuantitativa (Q-PCR)

Este es el procedimiento indirecto de medir cantidades iniciales de ARN, ADNc o ADN molde. La Q-PCR se utiliza generalmente para determinar rápidamente la cantidad de producto de PCR. La Q-PCR también se utiliza para la detección de secuencias específicas dentro de la muestra de ADN.

PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR o RTQ-PCR)

Este proceso utiliza tintes fluorescentes para monitorear y medir cantidades en tiempo real de productos amplificados. Esta PCR cuantitativa en tiempo real se utiliza en conjugación con QPCR.

PCR de contacto

Esta técnica reduce la unión del cebador no específico al disminuir la temperatura de hibridación entre dos ciclos consecutivos de PCR.

PCR de colonias

Se analizan los clones (Ej. E. coli) para los productos de ligación correctos. La colonia específica se extrae con un palillo de dientes estéril y se introduce en la mezcla maestra. La PCR se opera con tiempo extendido a 95oC.

PCR específica de alelos

Esta técnica se basa en el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), la PCR específica de alelo se utiliza a menudo con fines de clonación y diagnóstico. Se requiere algún conocimiento previo sobre la secuencia de ADN de los alelos y su diferencia. La PCR específica de alelos implica el uso de cebadores SNP que contienen el extremo 3 '. La amplificación por PCR específica de alelo exitosa y los cebadores específicos de SNP indican la presencia de un SNP particular en la secuencia.

Conjunto de ciclo de polimerasa (PCA) o PCR de conjunto

Implica la producción artificial de secuencias largas de ADN en presencia de oligonucleótidos largos y segmentos superpuestos cortos siguiendo el procedimiento estándar de PCR. Los oligonucleótidos largos giran en ambas direcciones (sentido y antisentido), el segmento superpuesto decide el orden de los fragmentos de PCR, lo que facilita la producción selectiva del ADN largo final.

PCR lineal después de la exponencial (LATE-PCR)

En esta técnica, el cebador limitante (cebador presente en la menor cantidad) tiene un punto de fusión más alto que el cebador en exceso (cebador presente en cantidad suficiente) para mantener la eficiencia de la reacción ya que la concentración del cebador limitante disminuye en el medio de la reacción. . 

PCR de salida

Es un método de recuperación de moléculas de ADN para la síntesis de genes. Una biblioteca de ADN se modifica con etiquetas flanqueantes específicas antes de la secuenciación. Posteriormente, los cebadores dirigidos a etiquetas permiten la recuperación del ADN de las secuencias deseadas mediante PCR.

Amplificación dependiente de helicasa

Está relacionado con la PCR tradicional, pero utiliza una temperatura constante en lugar de ciclos. Se usa ADN helicasa en lugar del paso de desnaturalización térmica. 

PCR de arranque en caliente

Esta técnica descarta la posibilidad de una amplificación no específica durante los ciclos iniciales de PCR. Los ingredientes de la reacción se calientan a una temperatura de desnaturalización de 95ºC.oC antes de la adición de polimerasa. Se introducen inhibidores y anticuerpos en la mezcla de reacción para inhibir ADN polimerasa actividad, que se disocia a altas temperaturas. 

PCR específica entre secuencias

Esta modificación de la técnica de PCR se utiliza a menudo para la identificación de huellas de ADN, que requiere la amplificación de regiones ubicadas entre las secuencias simples repetidas para generar una huella digital / patrón único y específico de fragmentos de ADN amplificados. 

PCR mediada por ligadura

Utiliza específicamente pequeñas moléculas enlazadoras de ADN (para insertar) y varios cebadores capaces de hibridar con el ADN enlazador. Esta técnica se utiliza ampliamente para la secuenciación de ADN y la huella.

PCR específica de metilación

Esta técnica se utiliza para la detección de islas CpG en el genoma. En la PCR específica de metilación, el ADN se trata con bisulfato de sodio, que convierte la base de citosina no metilada en uracilo, que es identificado / reconocido por las bases de timina del cebador de PCR. Se llevan a cabo dos conjuntos de PCR diferentes sobre el ADN alterado utilizando conjuntos de cebadores idénticos excepto para las islas CpG de los cebadores. Los conjuntos de cebadores reconocen las bases de citosina y otros conjuntos de cebadores reconocen el uracilo para amplificar el ADN no metilado. También se puede realizar Q-PCR para conocer la información cuantitativa sobre metilación. 

MCQ conceptuales sobre diferentes tipos de PCR (resuelto)

Pregunta 1: Un investigador está intentando alterar cinco pares de bases sucesivos en medio de fragmentos de ADN amplificados por PCR. ¿Qué técnica es la más recomendada para realizar dicho experimento?

A- ligadura de ADN

B- Ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)

C- mutagénesis por PCR

D- Enzima restrictiva digestión

Respuesta correcta: Opción C mutagénesis por PCR 

Explicación:

La técnica más recomendada para este tipo de modificaciones es la mutagénesis por PCR. Puede sintetizar cebadores que se unen de forma imperfecta al sitio deseado de mutagénesis. Estos cebadores ahora contendrán la nueva secuencia de 5 pares de bases que se introducirá en la nueva cadena de ADN. En primer lugar, la PCR amplificará el fragmento de ADN que contiene la secuencia mutante y las secuencias cadena arriba. El segundo ciclo de PCR amplificará la nueva cadena de ADN que contiene la secuencia mutante y también las secuencias posteriores. Y el ciclo final de la PCR amplificará un fragmento de ADN de las dos plantillas, utilizando los cebadores originales para amplificar la cadena de ADN de longitud completa.

Pregunta 2: La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utiliza una polimerasa termoestable (polimerasa Taq) para amplificar la cadena de ADN. ¿Cuál de las afirmaciones describe mejor por qué se requieren polimerasas termoestables para la PCR?

La A-PCR necesita ciclos térmicos y las polimerasas Taq pueden inactivarse ya que no son necesarias durante los pasos de baja temperatura. 

B- La polimerasa termoestable (Taq) no rompe el dsDNA a menos que la temperatura sea muy alta. Por lo tanto, se requiere una polimerasa termoestable (Taq).

C- La PCR necesita ciclos térmicos, y las polimerasas termoestables (Taq) no se desnaturalizan para perder eficacia en la polimerización del ADN durante la temperatura alta (95ºC).oC) paso. 

D- La interacción entre los cationes divalentes y la ADN polimerasa es mucho más eficiente durante los pasos de alta temperatura. Por tanto, la PCR requiere ADN polimerasa termoestable.

E- Las polimerasas termoestables (Taq) son más baratas que las polimerasas estándar; por tanto, son más adecuados para amplificar el ADN. 

Respuesta correcta: Opción C

La PCR necesita ciclos térmicos y las polimerasas termoestables (Taq) no se desnaturalizan para perder eficacia en la polimerización del ADN durante la temperatura alta (95ºC).oC) paso. Esto lo hace único entre los diferentes tipos de PCR.

Explicación:

Las polimerasas a menudo se desnaturalizan a temperaturas más altas. Si se usara una polimerasa estándar, se desnaturalizaría durante el paso de alta temperatura (desnaturalización), que es necesario para romper el ADN bicatenario en moldes de ADN monocatenario. Mediante el uso de esta polimerasa termoestable (Taq), el la enzima no se desnaturaliza. Las hebras de ADN continuarán amplificándose por la polimerasa Taq añadida al comienzo de la PCR.

Pregunta 3: ¿Cuál es el orden correcto de los tres pasos de PCR?

A- Extensión, desnaturalización, recocido

B- Desnaturalización, recocido, extensión 

C- Recocido, extensión, desnaturalización

D- Desnaturalización, extensión, recocido

Respuesta correcta: Opción B

Desnaturalización, recocido, extensión 

Explicación:

Los pasos de la PCR implican la desnaturalización, el recocido y la extensión.

La desnaturalización se realiza a una temperatura de alrededor de 94-98 ° C para romper los enlaces de hidrógeno del ADN de doble hebra. 

El recocido es el segundo paso de la PCR que se completa a 50-65 ° C. La etapa de hibridación debe realizarse a baja temperatura para la unión de los cebadores a la hebra única, pero lo suficientemente alta para evitar una hibridación inespecífica. 

El paso de extensión o elongación de la PCR permite que la ADN polimerasa sintetice la última copia de la cadena de ADN molde. La temperatura óptima depende de la ADN polimerasa que se utilice, pero suele oscilar entre 75 y 80 ° C.

Pregunta 4: ¿Cuál de los siguientes es / no es un componente de una mezcla de reacción en cadena de la polimerasa?

A- Solución tampón

B- ADN polimerasa

C- Formamida

D- hebra de plantilla de ADN

Respuesta correcta: Opción C

Formamida

Explicación:

Los ingredientes de la PCR son ADN (Taq) polimerasa, tampón, cebadores, cloruro de magnesio, dNTP (adenina, guanina, citosina, timina), desoxinucleótidos trifosfatos y la hebra de plantilla de ADN.

Conclusiones

En este artículo hemos discutido diferentes tipos de PCR. Para obtener más información sobre este tema, visite diferentes tipos de PCR.

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